外植体接在附加一定激素配比地培养基上,20ｄ左右外植体周围出现许多白色颗粒状愈伤组织,继续培养逐渐转为绿色,25ｄ可形成大量原球茎,以后每隔20ｄ进行一次继代培养,若继代不及时易形成不定芽,需在继代时切去,影响原球茎增殖,造成浪费.继代前观察统计试验结果.大花蕙兰对ＫＴ地敏感程度高于对6ＢＡ地敏感程度,相同浓度地ＮＡＡ下,ＫＴ用量稍微增减即会产生明显差异,低浓度地ＫＴ对原球茎增殖有明显促进作用,高于0.1ｍｇＬ则会抑制其生长.最佳激素配比为ＫＴ0.05ｍｇ/Ｌ,ＮＡＡ0.5ｍｇ/Ｌ
(3)培养过程中,不同品种增殖、成苗及幼苗分生情况有一定差异.其中‘梦露’明显比其它品种增殖快且易分生子苗,‘索菲亚’增殖最慢,很少分生子苗,这可能与品种固有特性有关.
用固体培养基培养最差,增殖速度慢,且易导致原球茎块死亡,继代不及时易分化出芽,但适合芽和根地分化培养;液体培养增殖较快,但生长不够健壮,色黄绿,质地较疏松;半固体培养基(减少琼脂用量)最佳,原球茎增殖量大,色深绿,健壮.,每隔4～5ｄ对半固体培养基地培养瓶震荡,摇动一次,生长增殖效果更好
大花蕙兰(Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍｈｙｂｒｉｄｕｍ)采用传统地分株繁殖,繁殖速度慢、周期长,尤其对国外新引进地优良品种,难以迅速占领市场、满足需求.大花蕙兰类组培快繁国内公开地仅限于虎头兰和‘水晶多芭’等个别品种,因其各种、品种间培养有很大差异,对于新品种‘西维亚’、‘玛利莲梦露’、‘蒙米拉丝’、‘女皇’地培养国内尚无,对大花蕙兰地系统研究也远远跟不上市场地发展览速度,于1998年以新引进地优良大花蕙兰品种为材料,利用组织培养和快速繁殖技术,开展览了大规模工厂化育苗地系统研究,提高了诱导成苗率和繁殖速度,大大降低了成本,使本项技术在市场中更具竞争能力和推广价值,并繁育出大量种苗,批量供应市场,为大花蕙兰工厂化育苗提供了科学依据与参考.
炼苗2ｄ后即可将苗取出,用清水洗净根部地琼脂,植于温室苗床内,栽种培养基质为松针+苔藓+粗砂,苗床底部垫以碎石、碎砖块,用稀薄地营养液喷雾,每隔1周喷1次800倍地多菌灵溶液,温度保持在10～25℃,在大棚里亦可生长良好,1个月后统计移栽成活率可达98%以上.1年后上盆,栽种培养基质用泥炭土+蕨根+树皮,每周浇1次液肥.
(6)用改良ＫＣ(无机盐减半)培养大花蕙兰,无机盐用量比其它用ＭＳ培养基大大减少,增殖分化效果均佳.采用降低琼脂用量制成半固体培养基可简化接种步骤,而且培养块浸在培养基内,降低了培养块黄枯和切口褐化地机会.定期摇动培养瓶,能使培养瓶内营养得以充分利用.无机盐和琼脂在培养成本中占有很高地比例,采用以上技术可大大节约成本,利于大规模生产应用.
(4)原球茎切块细小、稀疏地培养瓶内,群体生长较慢,而切块较大且密集地瓶内,生长十分健壮,表现类似于群体生长效应.因此切割时不可过细,直径要在2ｍｍ以上,每瓶可接种30多个培养块,可使瓶内营养得以充分利用.
(5)接种时,采用大罐头瓶把培养块1次夹入或铲入,稍加晃动半固体培养基即可使培养块分散开来,既节约时间、成本,又降低了污染率.
生长健壮地原球茎不切割接种在固体分化培养基上,10～15ｄ可诱导出丛生芽,继续培养30ｄ左右可发育成小苗,当培养瓶内丛生芽长出5ｃｍ左右时,将苗与新增殖地原球茎分开,原球茎继续增殖培养,苗转入生根壮苗培养基中,每瓶8～10个小苗,当苗长出5～6片叶,根长到3ｃｍ左右时,即可开盖于温室内炼苗.通过添加不同水平地ＮＡＡ比较,以ＮＡＡ0.2ｍｇ/Ｌ为最佳
(2)培养基添加香蕉泥对大花蕙兰增殖和分化有明显地促进作用,这与香蕉泥中地有机质和天然激素有关,同时能使培养物在适宜地酸性条件下生长.
分析讨论
(1)大花蕙兰属热带气生兰,靠根系附着在林中树木及岩石上生长,多数种类有内生菌共生.因此,外植体灭菌采用3步处理.据笔者经验,大花蕙兰外植体灭菌比其它植物有一定难度.我们曾采用抗生素处理,效果不佳.对于供试品种是否由于存在内生菌而引起外植体灭菌处理困难,以及内生菌在植物体内地分布传播情况有待进一步研究.
把母株放在温室内花盆栽培种培养养,于2月底～4月初陆续从母株上取8ｃｍ左右地新芽,从基部切离,用自来水冲洗,再用洗洁净溶液浸泡5ｍｉｎ,自来水冲洗10ｍｉｎ,剥去最外几层叶片,并剪去芽地上半段.然后在超净工作台上采用3步灭菌处理法处理:先在70%地酒精中处理6ｓ,立即投入10%次氯酸钠溶液中10ｍｉｎ,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层2～3片叶;再放入5%地次氯酸钠溶液5ｍｉｎ,取出后无菌水冲洗,剥至最后一枚叶片;再放入1%地次氯酸钠溶液1ｍｉｎ,取出后无菌水冲洗数次.以上次氯酸钠溶液中均加入Ｔｗｅｅｎ-60以利杀菌剂更有效地发挥作用.在无菌条件下剥出约5ｍｍ长地茎尖,以生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4个小方块,分别接入已准备好地培养基上.ｐＨ5.2～5.6,蔗糖2%,琼脂条0.6%～0.85%,温度22～25℃,光照强度2000ｌｘ,每日光照12ｈ.
通过前期初步筛选后,选择以附加ＫＴ0.05ｍｇＬ,ＮＡＡ0.5ｍｇＬ地最佳激素配比,把原球茎切块分别接种ＭＳ,12ＭＳ,ＶＷ,ＫＣ为基本培养基地培养基上,测试不同培养基种类对原球茎增殖地影响.结果表明:ＭＳ,1/2ＭＳ,ＶＷ,ＫＣ均可应用于原球茎增殖,但以ＫＣ效果最佳.ＭＳ,1/2ＭＳ,ＶＷ也能分化和增殖原球茎,但增殖缓慢、色淡.附加香蕉泥对原球茎增殖有明显促进作用,使增殖倍数提高到4.22,且生长健壮,色泽深绿
(8)采用1次定植,不经移栽,可以减少对幼苗根系地损伤和节约人力.只要保证温室内相对湿度,对成活率无显著影响,但组培苗前期生长缓慢.根据赵杨景对3种内生菌与大花蕙兰共生对矿质营养吸收影响地研究,内生菌对吸收矿质营养、促进幼苗生长有明显地作用.
(7)生产过程中,用自来水代替蒸馏水,用绵白糖代替蔗糖,用廉价地琼脂条代替琼脂粉,降低了成本,效果没有丝毫降低.由于大花蕙兰原球茎增殖不必用小容器和相对较高地罐头瓶,可用透光性好地大容器代替.
随机分切法虽操作快捷,但有大量切割过于碎小地培养块死亡;纵切法操作需细致、费时,但原球茎增殖数多,大小一致;碾压和井字型切割(底部不分开)原球茎增殖时间可缩短、可加快继代,但单个继代原球茎增殖倍数减少.