RFLp (Restn‘c：tion Fragment LenthPolymorphisms即限制性片段长度多态性)，是由Bostein等提出作为标记构建遗传连锁图谱的。其基本原理是利用核酸限制性内切酶识别DNA顺序上由特定碱基组成的识别点(即限制性位点)，将DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目与长度反映了DNA分子限制性酶切点的分布。就可发现探针在何处与限制性片段发生了杂交。1．2．1 RFLP标记。并显示出限制性内切酶酶切片段的大小，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。用绎过放射件同位素(通常用p32)标记的DNA作探针，与通过Southern印迹转移到支持膜(尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜)上的基因组总DNA杂交，滤膜经放射自显影
此外，还有人利用RAPD对狗牙根(cvlaodon spp．)进行标记研究，在对DNA扩增之前，用限制性酶消化DNA模板，再通过DNA扩增指纹，可以鉴定出狗牙根的各个品种。草坪草品种繁多．其中暖季型草坪草主要采用无性繁殖．利用DNA指纹分析技术对草坪草品种进行鉴定，不仪不受环境、发育阶段的影响，而且简便、快速、省时，能准确鉴定不同的品种、品系及其亲缘关系。Pasakinskine-I等用四种四核苷酸的SSR．标记分析两种黑麦草和两种羊茅(F araundinacea．F．pratensis)，每种的DNA样品包括3—6个栽培品种。其中一个SSR标记(Ac((；AC：A)。)能够有效地区分黑麦草和羊茅，虽然两种黑麦草之间的图谱较相似，但也有许多SSR标记可以区分出来，在栽培品种之间也存在少量指纹差异，它们可以鉴别栽培品种。结果显示四个种的DNA图谱差异明显
许多以前无法进行的研究在分子标记的帮助下也可以开展起来，并取得了一定的成就。③与基因表达无关．即在发育的不同阶段，不同组织的I)NA都可以用于标记分析，使得对植株基因犁的早期选择成为可能
RAPD技术是以一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链(通常为9～10bp)为引物，对所研究的基因DNA进行PcR扩增(高温变性——低温退火——中温延伸)，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB(溴化乙锭)染色来检测扩增产物片段的多态性，这些扩增I)NA片段的多态性反映了基因组和相应区域的DNA多态性(等位变异)Ⅲ。它继承了PcR的优点，具有样品用量少(通常15～25ng)、灵敏度高、特异性强和检测容易等特点，并且可以对没有进行任何分子生物学研究的物种进行DNA多态性分析，不具种属特异性，无需克隆、制备探针、分子杂交等工作，具有简便迅速、高效、实验成本低等优点。RAPI) (Randomlgv Amplifed Polymoiphic：DNA即随机扩增多态性DNA)，是由w：illiams等和welsh等两个研究小组同时发现的一种建立在pCR(Polymerase(2hain Reaction)基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记技术。1．2．2 RAPd 标记
2．4目标性状连锁基因标记
②在确定资源(品种)亲缘关系方面，通过对要确定亲缘关系的材料进行分子标记鉴定，可以快速确定材料间的亲缘关系
1分子标记的特点与种类
2。1品种鉴定与分类
1．2．4微卫星DNA标记。SSR标记是基因组中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的简单串联重复，由于重复的次数不同而产生多态性。微卫星DNA标记(Mk：rosatelliteDNA)是指以少数几个核苷酸(多数为2～4个)为单位多次串联重复的DNA序列，也称为简单序列重复(Simplesequence Repeats，SSR)。通过PcR技术将其从基因组DNA中特异性的扩增出来，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物．比较扩增产物的长短变化，达到基因组DNA之间多态性分析的目的
图谱，并与它的近源种——六倍体高羊茅(F．araundinaen)进行比较，用高羊茅的66个标记，构建了二倍体草地羊茅的图谱，其中有33个标记在两个种中高度保守连锁，这与过去昕推测的高羊茅的部分基因组起源于草地羊茅的观点一致．但是，两种之间在标记序列、图谱距离和同源连锁群方面存在显著差异，则说明由二倍体进化到六倍体，基因组产生了某些变异
对草坪草重要坪用性状的连锁基因进行标记、定位，并通过克隆测序将标记基因制探针，直接用于杂种早期选择、抗性鉴定等方面。这为黑麦草多种性状OTLs的确定和分子标记辅助育种奠定了基础。在草坪草育种工作中，利用DNA指纹分析技术，寻找与目标基因连锁较紧密的分子标记是辅助选择育种的手段之一。Roldan—RUlZ结合荧光检测技术，表明在多种商品化的黑麦草品种中，AFIP存在极为丰富的遗传多样性。这将显著提高草坪草育种效率，加速草坪草育种进程
以下就对各分子标记种类及其优缺点加以分析。虽然分子标记的种类很多，但是目前运用到草坪草研究中一般有RFLP、RAPI)、AFL，P和微卫星I)NA等四种分子标记
但存在实验程序比RAPD复杂，实验对DNA的纯度和内切酶的质量要求严格，以及成本高等不足之处。AFI，p技术在草坪上的应用尚处起步阶段，但其高效可靠的特点将使它在草坪草基因组研究中具有广阔的应用前景。AFI。p兼具RFLp、RAPD两种特长，而且能提供更多的基因组多态性信息，其标记可能是共显性或显性
①在资源利用方面，分子标记技术是迅速而有效的DNA检测工具，可以进行资源搜集和挖掘草坪草的重要坪用及抗性基因，进行分类整理，为草坪草育种提供原始材料或图谱克降重要基因
②大多数的分子标记的数量几乎是无限的
但RAPD也有它的缺点：
在操作中，通过控制模板DNA和Mg”浓度及严格保证反应条件，并严防环境污染，药品试剂、实验操作污染等，是解决RAPD重复性差的有效方法。因为在RAPI)反应体系中，引物的长度、引物的碱基成分及其排列顺序，Mg++离子浓度、引物和模板的浓度、Tag酶的浓度及种类、反应体积和反应次数等都会对扩增产物带型的特异性及扩增效率产生重要的影响。②RAPI)的检测受反应条件的影响较大，重复性差
关键词草坪草；遗传改良；分子标记
1．2．3 AFLp标记
该技术颇具特色之处在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接义及可与接头序列配对的专用引物，为此在不需要事先知道DNA序列信息的前提下，就可对酶切片段进行传统的扩增。AFLP (Amplified Fragment Length Polymorlehism即扩增片段长度多态性)，是由Zabeau和Vos发明的一种标记技术，其实质是RFLP和PcR相结合的产物。其基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性的扩增，使用双链人工接义(adapter)与该酶切片段相连接作为扩增反应的模板，在DNA聚合酶的作用下进行PcR反应
1．2分子标记的种类
3分子标记在草坪草研究上的应用前景
2分子标记技术在草坪草上的应用
①对表型无影响
将极大地推动草坪草的育种进程。综上所述，分子标记技术在草坪草种质资源发掘改良卜的广泛应用．将促使对草坪草遗传基础的更深入了解。促进目标基因在品种间的转移，使得草坪草种质资源的管理、利用和新品种的选育变得更加有效
1．1分子标记的特点
④在重要基因的分子克隆方面，通过对重要性状连锁基因进行标记、定位，通过克隆测序将标记基因制作成探针，直接可以应用于草坪草杂种后代的早期选择和鉴定
分子标记技术与经典的形态标记、细胞标记和生化标记相比，具有无可比拟的优越性：
但由于RFLP技术操作复杂、成本高、耗时长，且通常需要用同位素进行标记，这些都限制了FLP技术的使用和推广。RFLP是共显性标记，不受杂交组合方式的影响，可区分纯合体和杂合体，能可靠地进行数量性状基因的作图和定位，其标记数量较大，且非常稳定，实验结果可靠性强
2．2系谱分析
摘要：介绍RFLP、RAPD、AFLP和微卫星DNA分子标记技术的原理和特点，综述分子标记技术在草坪苹改良育种上的研究进展，并对其应用前景进行评述
2．3分子遗传图谱的构建
研究表明：高羊茅与二倍体羊茅(praterLsts)、四倍体羊茅(F．．arundinacca)以及多年生黑麦草(Loliumperenne)的亲缘关系都是比较近的，但是与四倍体羊茅的亲缘关系最近。Hit2，等用草地早熟禾(Poapratensts L1)为研究材料，通过改进银染聚丙烯酰胺凝胶的方法，利用RAPD标记，确定了源于兼性无融合生殖变异株的遗传起源。Weaver等人通过DNA扩增指纹，用任意的核苷酸序列作为引物鉴定假俭草(Eremochloa ophiuroides)的遗传多样性及其变异情况，以便找到该品种的原始种。DNA标记所检测的是植物基因组DNA水平上的差异．因而它非常稳定、客观。近年来，利用分了标记技术从DNA水平上对草坪草各品种间的亲缘关系、起源及进化等进行了研究探讨，取得了较大进展。有人对高羊茅(F Iundinaceo．schreb)和黑麦草(工．multiLUFLO一Fun，L．perertr)进行了RFLP标记，通过构建树状图，对两者之间的遗传关系进行了确定
分子标记是以生物的大分子，尤其是生物体的遗传物质——DNA的多态性为基础的遗传标记。而对于国内运用分子标记对草坪草进行研究还不及在农作物上做得深入，而且也由于缺少可利用的标记，这些都很大程度上限制了对草坪草进行更加深入系统的研究．也影响了改良育种的进程。许多国内外学者已开始利用其他植物的分子标记对草坪草进行品种的鉴定、选育以及种质资源的保护。分子标记的建立与分析，是育种工作中对目标基因进行鉴定与选择的重要工具
根据分子遗传图谱和重要基囚的分子标记．进行早期选择．筛选出含有目的基因的植株，这将大大提高选择的准确性和育种效率，从而可以大大加快草坪草的育种进程
分子标记的应用为草坪草遗传育种研究开辟了新的途径，为草坪草种质资源和品种的鉴定、分类、遗传图谱构建及目标性状基因标记等提供了理想的方法。具体表现在：
但其所用引物具有高度种属特异性，引物设计需投入大量人力物力。同一物种两个随机个体的DNA指纹完全相同的概率仅为三干亿分之一。DNA指纹遵循简单的孟德尔遗传，岳代中的每一条带，都可以在双亲之一的指纹中找到，除非基因突变产生的新带。此标记为共显性标记，还可作为RFLP探针使用，并且具有如下优点：①多位点性。④DNA用量少，质量要求低，检测快速，信息量大。DNA指纹绝大多数是独立遗传的，一个DNA指纹图能够同时检测到基因组中数十个位点的变异。②高度变异性。③遗传方式简单稳定
①RAPD检测的多数位点的标记带表现为显性特点，因而不能提供完整的遗传信息
SlerIer等运用RFLP标记构建二倍体草地羊茅(F．pratensis)。遗传连锁图谱(Genetic link：agemap)可用来描绘基因或其他遗传标记在染色体上的相对位置。遗传图谱的构建，可以提高育种工作的预见性。Bert等采用17个引物对3个同工酶、5个EST标记，确定了463个AFLP片段，用这些AFLP片段成功地构建了多年生黑麦草(Lperenne)7个连锁群的高密度图谱，可以用于数量性状位点QTL的检测
③在草坪草遗传育种中，根据育种目标，设计出能最大限度地综合利用有利基因和避免不利基因的最佳杂交组合，这将有力地促进草坪草品种的改良。通过转基因技术有目的的将所需基因导入，然后对杂交后代群体